地肤子PCR鉴定试剂盒说明书

特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据地黄保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

使用方法：
一、样品采集：
1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验要求进行。
2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。 
二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购上海泽叶生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议在样品制备区域加入阳性对照。 
实验流程：
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器 、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
7. 仪器 扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
储存条件：
14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
CXCL16 Others Canine 狗 CXCL16 / SR-PSOX 人细胞裂解液 (阳性对照) 酸浆苦味素L（标准品）Physalin L质量规格：供鉴别用

CM-R114大鼠视网膜微血管内皮细胞*培养基100mL1-甲基海因（标准品）1-METHYLHYDANTOIN质量规格：供鉴别用

KYSE70细胞，人食管鳞癌 神经胶质瘤细胞,SHG-44细胞 猪肾传代细胞;IBRS-2古伦宾（标准品）Columbin质量规格：供含量测定用

CFPAC-1(人胰腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2安五脂素（标准品）Anwuligan质量规格：鉴别

TNFSF8 Others Human 人 CD30 Ligand / TNFSF8 人细胞裂解液 (阳性对照) 络石苷（标准品）tracheloside质量规格：含量测定
IGFBP3 Others Cymolgus 食蟹猴 IGFBP3 人细胞裂解液 (阳性对照) DL-DL-Arginine质量规格：HPLC≥98%，标准品

肝实质细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)L-鼠李糖(标准品)L(+)-Rhamse mohydrate质量规格：HPLC≥98%，标准品

MOLT-4细胞，人急性T母细胞白血病细胞 大鼠卵巢癌细胞株,NUTU-19细胞 人外根壳细胞cDNAHHORSC cDNAL-鼠李糖；鼠李糖一水L(+)-Rhamse mohydrate质量规格：≥98%，BR

NCTC 1469(小鼠正常肝细胞) 5×106cells/瓶×2鼠尾草酚(标准品)Carsol质量规格：HPLC≥95%，标准品

COLO 205(人结肠癌细胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0158MGC80-3(人胃癌细胞)5×106cells/瓶×2 大鼠肝细胞;BRL鼠尾草酸（标准品）Carsic acid质量规格：HPLC≥98%，标准品
家猫肾细胞;CATK1BAEE;N-苯甲酰基-L-乙酯盐酸盐质量规格：>98%,BRBAEE

HA Others H3N2 甲型流感 H3N2 (A/Brisbane/10/2007) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) ATEE；N-乙酰-L-乙酯质量规格：>98%,BRN-Acetyl-L-tyrosine ethyl ester mohydrate

CL-0378MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)5×106cells/瓶×2β-D-葡糖糖-6-1酸钠盐质量规格：98%，美国进口D-Glucose 6-phosphate  salt

EFNA5 Others Rat 大鼠 Ephrin-A5 / EFNA5 人细胞裂解液 (阳性对照) NADPH;还原辅酶Ⅱ四钠盐;(美仑)质量规格：>97%,国产美仑Coenzyme II reduced tetra salt(NADPH)

小鼠肺成纤维细胞*培养基 100mL葡萄糖氧化酶质量规格：BR,>200U/mgGlucose oxidase
地肤子PCR鉴定试剂盒说明书Promocell C-25110 Hepatocyte Growth MediumKIT, 肝细胞生长培养基套装 500ml9,9'-螺二[9H-芴](>98.0%(HPLC))质量规格：>98.0%(HPLC)9,9'-Spirobi[9H-fluorene]

人心肌细胞-心房总RNAHCF-aa NA2-氨基蒽(>98.0%(GC)(T))质量规格：>98.0%(GC)(T)2-Amianthracene

CD38 Others Cymolgus 食蟹猴 SCARB3 人细胞裂解液 (阳性对照) 1